(C/N:CE604)

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1．概要

軟骨藻酸（Domoic acid，DA）是一種天然神經性氨基酸，要由某些擬菱形藻屬和菱形藻屬的海洋矽藻產生，人們食用毒化的貝類，可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等症狀，根據這種毒素的中毒特征，被命名為記憶喪失性貝毒（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）。研究發現，貝組織中軟骨藻酸含量達到40mg／kg時可引起食用者中毒，150mg／kg 時有致死危險，人類通過進食可耐受的最大為20mg/kg。

2．原理

本試劑盒采用間接競爭法。酶標板微孔中預包被軟骨藻酸毒素抗原，樣品中殘留的軟骨藻酸毒素與微孔板上的抗原競爭軟骨藻酸毒素抗體，加入酶標二抗後，用TMB顯色，吸光值與樣品中軟骨藻酸毒素含量成負相關。

3．試劑盒組成

1）包被有抗原的96微孔板：1塊（96孔，12條×8孔）

2）標準品工作液：0、0.3、1.0、3.0、9.0ng/mL        1瓶x1mL

3）軟骨藻酸毒素抗體：        1瓶x8mL

4）酶標二抗：        1瓶x15mL

5)        10x濃縮洗滌液：        1瓶x50mL

6）樣本希釋夜：        2瓶×50mL

7）顯色底物液（TMB）：        1瓶×17mL

8）終止液：        1瓶×7mL

9）試劑盒說明書

10）質檢報告

4．需要的儀器、試劑

1）儀器

酶標儀450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）

離心機

微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

-50mL離心管、8道微量移液器酶標板振蕩器 

天平：感量0.01g

2）試劑

去離子水

甲醇

5．樣品處理

5.1貝類樣本

1）去除貝殼取出貝肉，將貝肉樣本均質；

2）稱取1.0g均質好的樣本於10mL離心管中；

3）加入4mL50％甲醇水，劇烈震蕩5min；

4）室溫4000r／min離心10分鍾；

5）取上清液20μL到980μL樣本希釋夜中，混勻；

6）取50μL混勻液用於檢測。

稀釋倍數：200

6．酶聯免疫分析程序

6.1測定之前注意事項

1）使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。

2）使用後迅速將試劑放入2-8℃冷藏。

3）在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4）所有孵育過程應避免陽光直射，並按要求用蓋板覆蓋住酶標板。

6.2 溶液的配製

1）洗滌液的配製：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍後使用（1份濃縮洗滌液加9去份離子水）。

2） 50％甲醇水的配製：量取50mL甲醇加入50mL 去離子水。

6.3測定程序

1）將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準品和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。

2）分別吸取50μL標準品和樣品加至相應的微孔（雙孔）中，然後各加入50μL軟骨藻酸毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鍾（每個標準品和樣品必須使用新的吸頭）。

3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然後每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩後倒出孔中的液體，拍幹；重複操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完後用力在吸水紙上拍幹。

4）加入100μL酶標二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鍾（每個標準品和樣品必須使用新的吸頭）。

5）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然後每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩後倒出孔中的液體，拍幹；重複操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完後用力在吸水紙上拍幹。

6）每孔加入100μL底物，室溫避光溫育10分鍾。

7）每孔加入50μL終止液，混勻。

8）置於酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa 全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7．結果判定

1）所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準品（0標）的吸光度值（Bo）再乘以100％，即百分吸光度值。百分吸光度值

以軟骨藻酸毒素標準品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件，更便於大量樣品的快速分析。

2）樣品的實際濃度為讀數結果乘以相應稀釋倍數。 

3）如果測定值超出檢測範圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩衝液進行稀釋。

8．注意事項

1）室溫低於20℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導致數值偏低。

2）在洗板過程中如果出現板孔幹燥過久的情況，則會出現標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。

3）標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。

4）混合要均勻，洗板要充分（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。

5）反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。

6）不要使用過期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產廠家的試劑盒這樣會引起靈敏度降低。 

7）試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9．檢測方法靈敏度、準確度、精密度、交叉反應率

1）精密度：批內變異係數＜10％(n=10)

批間變異係數＜25％（n＝10）

2）靈敏度：0.3ng／mL。

3）樣本檢測線：

貝類        60ng/mL

4）準確度：

貝類        90%±25%

5）交叉反應率：

軟骨藻酸        100%